DNA extraction from plant tissues (DNA 추출 방법)

출처 : google 이미지 "arabidopsis thaliana flower"

흔히 DNA 추출을 깨끗하게 하기 위해서는 CTAB buffer를 사용하지만, 간단한 방법을 소개해 보려고 한다. 손톱만큼의 잎으로도 PCR을 하기엔 충분한 DNA를 얻을 수 있는 방법이다. 유기용매인 chloroform을 사용하지 않아도 되는 방법이다. DNA 추출하는 방법은 추출한 DNA로 무슨 실험을 할 것인가에 따라 양과 사용하는 buffer와 시약이 달라지므로, 아래의 방법은  PCR 확인을 위한 간단한 방법이라고 생각하면 된다. 또한 모델 식물인 애기장대 (Arabidopsis thaliana)  기준으로 만들어진 protocol이지만, 다른 식물에도 충분히 적용은 가능할 것이라 생각된다. 참고로, cloning을 위해 DNA를 뽑아야 한다면 CTAB과 chloroform 사용을 권한다. TAIR (www.arabidopsis.org)에서 제공하는 one-step DNA extraction protocol로만 사용하면 PCR이 잘 안 되는 경우가 많다. 특히 700 bp 이상은 힘들다. 따라서 변형한 방법은 아래와 같다. 

 

1.  extraction buffer 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, and 0.5% SDS 200 ul 에 손톱 크기 정도의 크기의 잎을 넣고 pestle로 눌러서 갈아준다. chlorophyll 색이 solution에 보일 정도면 충분하다.

(beads beater로 간 후,  extraction buffer 200 ul를 넣어 vortexing 해 주어도 된다.) 

2. centrifuge tube at 13000rpm for 5 min (RT or 4c)

3. supernatant 를 새로운 e-tube로 옮겨준 후 isoprophanol 140ul를 넣어 inverting이나 짧은  vortexing을 해 준다.

4. RT 또는 -80c (deepfrezer)에 10분 incubation.

5. centrifuge tube at 13000 rpm for 10 min (RT or 4c)

6. pellet을 70% Ethanol로 washing 해준다. (1 ml  inverting ->  centrifuge tube at 13000rpm for 1 min)

7. 남은 Ethanol을 완전히 제거 해 준 후, 65c에서 tube안의 pellet을 완전히 말려준다.

8. TE 또는 TDW 로 30 - 50 ul elution -> Add 2 μL of this DNA to in total 20 μL of PCR reaction. 

 

<One-step DNA extraction from Arabidopsis thaliana>

Overview

To lessen labor, time or cost of DNA extraction, we established a one-step method of DNA extraction from Arabidopsis. After several trials, we found that a diluted extraction buffer from a known protocol (Edwards et al. 1991) can be successfully used to extract DNA in one step. This is one of the one-step protocols for DNA extraction from Arabidopsis.

Notes

This protocol is aimed for the extraction of DNA that is used as PCR template, and not for DNA isolation per se. Additionally, experiments might not be successful when the ratio of plant sample to extraction buffer is greatly changed, plant tissue is vigorously crushed with machines, or the volume of extract added to PCR reaction is increased.

Preparation

Edwards Solution (200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, and 0.5% SDS) TE Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8) and 1 mM EDTA) (Dilute Edwards Solution by 10-fold with TE Buffer to obtain Extraction Buffer) Leaf sample (3–5 mg) 1.5 mL plastic tube Plastic rods that fit the tube (Wash and sterilize with autoclave)

Protocol

Place leaf sample in plastic tube. Add 200 μL Extraction Buffer to the tube. Crush leaf with plastic rod against the tube wall. The solution turns transparent green, and visible tissue residue is left in the solution. This solution can be successfully used in the following PCR reaction. If you want to remove tissue residue, centrifuge tube at 14,000 rpm for 5 min and recover supernatant. This solution is stable at -20oC for several months with or without tissue residue. Add 1 μL of this solution to in total 20 μL of PCR reaction. Addition of 2 μL inhibits PCR reaction.

References

Kasajima I., Ide Y., Ohkama-Ohtsu N., Yoneyama T., Fujiwara T. (2004) A protocol for rapid DNA extraction from Arabidopsis thaliana for PCR analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 22, 49-52

Edwards K., Johnstone C., Thompson C. (1991) A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl. Acid. Res. 19: 1349